Il riquadro raffigura in un'unica composizione i due momenti fondamentali della Caduta dell'uomo narrati nella Genesi: a sinistra Adamo ed Eva colgono il frutto dell'albero della conoscenza, mentre a destra l'angelo li scaccia dal Paradiso terrestre.
Al centro della scena si trova l'albero attorno al quale si avvolge la serpente con busto femminile, secondo una tradizione iconografica medievale. Michelangelo organizza i due episodi intorno all'albero, trasformandolo nel principale elemento compositivo e creando una forte contrapposizione tra la condizione dell'uomo prima e dopo il peccato.
La Caduta e Cacciata dei progenitori costituisce uno dei momenti più complessi del programma della volta della Cappella Sistina. Michelangelo concentra nello stesso spazio due episodi consecutivi della Genesi, creando una narrazione che si sviluppa da sinistra verso destra: prima la tentazione e il peccato, poi la perdita del Paradiso.
L'albero collocato al centro ha una funzione fondamentale. Non è soltanto l'elemento intorno al quale si svolge l'episodio della tentazione, ma diventa anche un vero e proprio asse di separazione tra due condizioni dell'umanità. A sinistra Adamo ed Eva appaiono ancora immersi in una dimensione di armonia; a destra, dopo il peccato, i loro corpi si contraggono e assumono atteggiamenti carichi di paura e sofferenza.
La figura della serpente con busto femminile riprende una tradizione iconografica già presente nell'arte medievale e rinascimentale. Questa soluzione non nasce quindi con Michelangelo, ma viene da lui reinterpretata all'interno di un linguaggio figurativo completamente nuovo. Il tentatore assume quasi l'aspetto di una figura umana seducente, accentuando il carattere ambivalente della tentazione.
Uno degli elementi più potenti dell'opera è il contrasto psicologico e fisico tra le due metà della composizione. Prima della Caduta, Adamo ed Eva mostrano corpi equilibrati e relativamente distesi; dopo la cacciata, Michelangelo li rappresenta rannicchiati, piegati e vulnerabili. La trasformazione spirituale viene quindi tradotta direttamente nella forma dei corpi.
L'angelo che caccia i progenitori introduce nella scena una forte energia diagonale. La sua presenza rende improvviso e irrevocabile il passaggio dalla condizione paradisiaca alla condizione terrena. La drammaticità non deriva soltanto dall'episodio narrato, ma dalla stessa costruzione delle figure e dalla loro relazione nello spazio.
La scena assume così un significato più ampio rispetto alla semplice illustrazione della Genesi: il peccato originale diventa una riflessione sulla condizione umana, sulla perdita dell'armonia originaria e sulla conseguente separazione dell'uomo da Dio.